Historia współczesnej Biblioteki Watykańskiej rozpoczyna się w połowie XV wieku, kiedy to Mikołaj V, wielki humanista i miłośnik sztuk pięknych, zadbał o jej prawidłową organizację. Zgromadził on wszystkie cenne rękopisy w jednym miejscu, zaś do odziedziczonych po swych poprzednikach zbiorów dołączył swą prywatną kolekcję. Jego wysłannicy szukali zaś nowych okazów w krajach Azji i Europy. Pod koniec pontyfikatu Mikołaja V zbiory watykańskie liczyły około 1500 manuskryptów. Był to największy księgozbiór w renesansowej Europie.

W 1475 roku papież Sykstus IV nadał bibliotece status prawny. Papież ten udostępnił również część watykańskich zbiorów studentom oraz naukowcom. Mogli oni korzystać z ksiąg w czytelni. Do połowy XVI wieku istniała również możliwość wypożyczania książek. Pod koniec XVI stulecia powstał nowy gmach Biblioteki Watykańskiej. Na jego najwyższym piętrze mieściła się czytelnia. Pomieszczenie to nosi obecnie nazwę Sali Sykstyńskiej.

Na początku XVI wieku papież Paweł V wyodrębnił ze zbiorów materiały archiwalne, które dały początek Sekretnym Archiwom Watykanu. W XVIII wieku wyodrębniono kolekcję numizmatów oraz utworzono muzeum ze zbiorami sztuki sakralnej oraz drugie muzeum, ze zbiorami sztuki świeckiej.

Oprócz cennych ksiąg w Watykanie zgromadzono również cenne grafiki oraz rysunki. Znajdują się tu także wybitne dzieła literatury azjatyckiej oraz słynne rozprawy naukowe. Znaleźć tu można również skarby dawnej kartografii oraz astronomii. Zbiory zgromadzone w Bibliotece Watykańskiej są bardzo różnorodne i świadczą o dużej otwartości papieży na wiedzę świecką oraz dokonania cywilizacji leżących w innych kręgach wyznaniowych.